乙酰化濾紙層析熒光分光光度法

Water quality—Determination of benzo（a）-Pyrene-Acetylated

paper chromatography with fluorescence spectrophotometric method

GB 11895—89

1 主題內(nèi)容與適用范圍

本方法規(guī)定了測(cè)定水質(zhì)中苯并（a）花[以下簡(jiǎn)稱B（a）P]的方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于飲用水、地面水、生活污水、工業(yè)廢水。zui低校出濃度為0.004μg／L。

注意：B（a）P是一種由五個(gè)環(huán)構(gòu)成的多環(huán)芳烴，它是多環(huán)芳烴類的強(qiáng)致癌代表物。基于B（a）P的強(qiáng)致癌性，按本標(biāo)準(zhǔn)方法分析時(shí)必須戴抗有機(jī)溶劑的手套，操作應(yīng)在白搪瓷盤中進(jìn)行（如溶液轉(zhuǎn)移、定容、點(diǎn)樣等）。室內(nèi)應(yīng)避免陽(yáng)光直接照射，通風(fēng)良好。

2 原理

水中多環(huán)芳烴及環(huán)已烷可溶物經(jīng)環(huán)己烷萃取（水樣必須充分搖勻），萃取液用*脫水、濃縮，而后經(jīng)乙酰化濾紙分離。分離后的B（a）P用熒光分光光度計(jì)測(cè)定。

3 試劑

除另有說明外，分析時(shí)均使用分析純?cè)噭┖驼麴s水。

3.1 B（a）P標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取5.00mg固體標(biāo)準(zhǔn)B（a）P于50mL容量瓶中[因B（a）P是強(qiáng)致癌物，為了減少污染，以少轉(zhuǎn)移為好]，用少量苯溶解后，加環(huán)已烷至標(biāo)線，其濃度為100μg／mL。特此貯備液用環(huán)己烷稀釋成10μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，避光貯于冰箱中。

3.2 乙酷化濾紙的制備：把15×30cm的層析濾紙15至20張卷成高15cm的圓筒狀，逐張放入1000mL高型燒杯中，杯壁與靠杯的*張紙間插入一根玻璃棒，杯中間放一枚玻璃熔封的電磁攪拌鐵芯。在通風(fēng)柜中，沿杯壁慢慢倒入乙酰化劑（由苯十乙酸酐＋濃硫酸＝750mL＋250mL＋0.5mL混合配制成），磁力恒溫?cái)嚢杵鞯臏囟缺３?span lang="EN-US">55±1℃.連續(xù)反應(yīng)6h。取出乙酰化濾紙，用自來水漂洗3～4次，再用蒸餾水漂洗2～3次，晾干。次日用無水乙醇浸泡4h后，取出乙酰化濾紙，晾干壓平，備用。

3.3 環(huán)己烷，重蒸。用熒光分光光度計(jì)檢查：在熒光激發(fā)波長(zhǎng)367nm，狹縫10nm；熒光發(fā)射狹縫2nm，波長(zhǎng)405nm應(yīng)無峰出現(xiàn)。

3.4 丙酮，重蒸。

3.5 甲醇。

3.6 乙醚。

3.7 苯，重蒸。

3.8 乙酸酐。

3.9 硫酸，ρ＝1.84g／mL。

3.10 *。3.11 二甲基亞礬（DMSO）：用前先用環(huán)已烷萃取兩次（500mL二甲基亞礬加50mL環(huán)已烷萃取）。棄去環(huán)己烷后備用。

4 儀器

常用實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和下列儀器。

4.1 備有紫外激發(fā)和熒光分光的熒光分光光度計(jì)，光程為10mm的石英比色皿。

4.2 紫外分析儀（帶365nm或254nm的濾光片）。

4.3 康氏振蕩器。

4.4 磁力恒溫?cái)嚢杵鳌?span lang="EN-US">

4.5 立式離心機(jī)，轉(zhuǎn)速為4000r／min。

4.6 分液漏斗，1L、3L、100mL。活塞上禁用油性潤(rùn)滑劑，活塞直接用水或有機(jī)溶劑潤(rùn)滑即可。

4.7 錐形瓶，250mL。具磨口玻璃塞。

4.8 恒溫水浴鍋。

4.9 層析缸。

4.10 具磨口塞刻度離心管，5mL。

4.11 點(diǎn)樣用玻璃毛細(xì)管（自制）。

4.12 分析天平、感量0.01mg。

5 樣品保存

水樣應(yīng)貯于玻璃瓶中并避光，當(dāng)日（24h內(nèi)）用環(huán)己烷萃取，環(huán)已烷萃取液放入冰箱中保存。

6 步驟

6.1 樣品和標(biāo)樣的預(yù)處理

6.1.1 清潔水和地面水萃取

取充分混勻的清潔水樣2000mL放入3000mL分液漏斗中，用環(huán)己烷萃取兩次，每次用50mL，在康氏振蕩器上每次振蕩3min，取下放氣，靜置半小時(shí)，待分層后，將兩次環(huán)已烷萃取液收集于具塞錐形瓶中，棄去水相部分。

6.1.2 工業(yè)廢水的萃取

取混勻的工業(yè)廢水樣1000mL，放入1000mL分液漏斗中，每次用50mL環(huán)已烷萃取兩次，在康氏振蕩器上每次振蕩3min，取下放氣，靜置半小時(shí)，待分層后，將兩次環(huán)已烷萃取液收集于具塞錐形瓶中，棄去水相部分。

6.1.3 脫水、濃縮

在（上述）環(huán)已烷萃取液中加入*（約20～50g），靜置至*脫水（約1～2h），至具塞錐形瓶底部無水為止。如果環(huán)已烷萃取液顏色比較深，則將脫水后環(huán)已烷定容至100mL，分取其一定體積濃縮；如果顏色不深則全部濃縮。在溫度為70～75C用KD濃縮器減壓濃縮至近干，用苯洗滌濃縮管壁三次，每次用3滴，再濃縮至0.05mL，以備紙層析用。

6.1.4 紙層析分離

在乙酰化濾紙30cm長(zhǎng)的下端3cm處，用鉛筆畫一橫線，橫線兩端各留出1.5cm，以2.4cm的間隔將標(biāo)準(zhǔn)B（a）P與樣品濃縮液用玻璃毛細(xì)管交叉點(diǎn)樣。點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不超過3～4mm。點(diǎn)樣過程中用冷風(fēng)吹干。每支濃縮管洗兩次，每次用一滴苯，全部點(diǎn)在紙上。將點(diǎn)過樣的層析濾紙掛在層析缸內(nèi)架子上，加入展開劑[甲醇＋乙醚＋蒸餾水＝4＋4＋1（體積比）]，直到濾紙下端浸入展開劑1cm為止。加蓋用透明膠紙密封。于暗室中展開2～4h。取出層析濾紙，在紫外分析儀照射下用鉛筆圈出標(biāo)樣B（a）P斑點(diǎn)以及樣品中與其高度（Rf值）相同的紫藍(lán)色斑點(diǎn)范圍。

剪下用鉛筆圈出的斑點(diǎn)，剪成小條，分別放入5mL具塞離心管中。在105～110℃烘箱中烘10min（亦可在干燥器中或干凈空氣中晾干）。在干燥器內(nèi)冷卻后、加入丙酮至標(biāo)線。用手振蕩1min后，以3000r／min的速度離心2min。上清液留待測(cè)量用。

6.2 測(cè)定

將標(biāo)準(zhǔn)B（a）P斑點(diǎn)和樣品斑點(diǎn)的丙酮洗脫液分別注入10mm的石英比色皿中，在激發(fā)、發(fā)射狹縫分別為10nm、2nm，激發(fā)波長(zhǎng)為367nm處，測(cè)其發(fā)射波長(zhǎng)402nm、405nm、408nm處的熒光強(qiáng)度F。

7 結(jié)果的表示

用窄基線法按下列公式計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)B（a）P和樣品B（a）P的相對(duì)熒光強(qiáng)度，再計(jì)算出B（a）P的含量C（用相對(duì)比較計(jì)算法）。

式中：C——水樣B（a）P含量，μg／L；

M——標(biāo)準(zhǔn)B（a）P點(diǎn)樣量，μg；

F_{標(biāo)準(zhǔn)}——標(biāo)準(zhǔn)B（a）P的相對(duì)熒光強(qiáng)度；

F_樣品——樣品斑點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；

V——水樣體積，L；

R——環(huán)己烷提取液總體積與濃縮時(shí)所取的環(huán)己烷提取液的體積之比值。

8 精密度與準(zhǔn)確度

8.1 精密度

五個(gè)實(shí)驗(yàn)室自行配制的含有B（a）P近似O.2μg／L的焦化廢水的精密度見表1。

表1 精密度

8.2 準(zhǔn)確度

兩種工業(yè)廢水的加標(biāo)回收率見表2、表3。

表2 焦化廢水加標(biāo)回收結(jié)果

表3 瀝青廢水加標(biāo)回收結(jié)果

附錄A 對(duì)除去B（a）P干擾物的說明

（補(bǔ)充件）

A1 石油、含油廢水按下面操作進(jìn)行 將上述（6.1.2）100mL環(huán)己烷萃取液定容后取出20mL，放入100mL分液漏斗。用DMSO萃取2次，每次5mL，用手振蕩2min，注意放氣，靜置半小時(shí)。待分層后收集兩次萃取的DMso液于另一個(gè)100mL分液漏斗中，棄去環(huán)己烷液。于盛有10mLDMSo液的分液漏斗中加入事先用冰冷卻過的1：1HCl15mL，冷卻至室溫，再用環(huán)己烷反萃取兩次，每次5ml，用手振蕩2min，注意放氣。合并兩次環(huán)己烷萃取液10mL于另一個(gè)100mL分液漏斗中，加5mL15％NaOH溶液洗一次，振蕩兩分鐘，棄去NaOH液層。再用蒸餾水洗2—3次，每次15mL，直至洗滌后的蒸餾水pH＝7，棄去水相，將環(huán)己烷萃取液加無水流酸鈉脫水后，在KD濃縮器上濃縮。以下步驟包括乙酰化濾紙層析分離，熒光分光光度計(jì)測(cè)量，計(jì)算與（7）相同。

A2 測(cè)量后的B（a）P丙酮洗脫液切勿隨意丟棄，可放入通風(fēng)柜中大燒杯中，統(tǒng)一處理。

A5 本實(shí)驗(yàn)均應(yīng)在避免陽(yáng)光直接照射下進(jìn)行。

A4 所用玻璃器皿必須用洗液浸泡4h以后洗滌。