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TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)
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� � � | TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法) |
- 【資料簡介�
TUNEL細胞凋亡檢測試劑�(顯色�)(石蠟切片)
Cat Number:BA2150
Specification�50 �
Store at: -20� for one year
MADE BY BIOBOX
TUNEL細胞凋亡檢測試劑� (顯色�)(石蠟切片)
一、產品簡�
TUNEL細胞凋亡檢測試劑�(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡�
的細胞凋亡檢測方法。對于待檢測的細胞或組織樣品,經�*標記和后續的 DAB 顯色等步驟,即可在普�
光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞�
細胞在發生凋亡時,會激活一些DNA內切酶,這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提
DNA進行電泳檢測,可以發�180-200bp 的DNA ladder。基因組DNA 斷裂時,暴露�3�-OH可以在末端脫�
核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上*(Biotin)標記的dUTP(Biotin-dUTP)�
隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結合,zui后在HRP的催化下通過DAB顯色�
顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞;由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA
的斷裂,因而沒�3'-OH形成,很少能夠被標記。這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細
胞凋亡的原理�
本試劑盒適用于石蠟包埋組織樣本的凋亡原位檢測�
本試劑盒有如下優點:
1� 高靈敏度:可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡,同時由于凋亡早期就有DNA斷裂,可以檢測到早期的細
胞凋亡�
2� 操作簡便:使用Ready-to-Use型試劑,并配有蛋白酶 K 和DAB�
3� 特異性:TUNEL檢測時通常更容易標記凋亡細胞,而不容易標記壞死細胞�
4� 快速:僅需�3個小時即可完成�
5� 方便觀察:使用光學顯微鏡觀察實驗結果,無需貴重設備�
二、試劑盒組份
� � Cat: BA2120 Cat: BA2150 Cat: BA21100 儲存條件
平衡� 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20�
TdT � 80μL 200μL 400μL -20�
50×蛋白� K 40μL 100μL 200μL -20�
Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避�
Biotin-dUTP 20μL 50μL 100μL -20�
DAB 2mg 5mg 10 mg -20℃避�
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
二甲苯、甲醇、乙醇、PBS、H2O2
、TritonX-100、檸檬酸鈉、復染染液:蘇木素或甲基綠等�
蓋玻片、載玻片、染色缸、染色濕盒、光學顯微鏡�37℃孵箱、移液器等�
四、保存條件:
-20℃保存,其中Streptavidin-HRP 4℃保存,Streptavidin-HRP和DAB需避光保存�
五、注意事項:
1、TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產生的DNA斷裂,但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂(和細胞凋亡時
2
的斷裂方式不�)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區分開,另一方面也不會把射線等誘導發� DNA 斷裂�
非凋亡細胞判斷為凋亡細胞�
2、極少數細胞凋亡時沒� DNA 斷裂,此時不適用 TUNEL 法檢測。在個別類型的壞死細胞中也發� TUNEL
檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下,同時檢測多個凋亡指標�
3、使用前請認真閱讀本說明書,提前準備好相關試劑�
4、因本試劑盒中組分均為微量,使用前請離心�
5、為避免試驗誤差、降低試劑的損耗,建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭�
6� TdT 酶反應液在使用前根椐樣本數量集中配制,再分別滴加于各樣本片上,避免每個樣本單獨配制�
產生的試劑損耗�
7、DAB為固體粉末,使用前加入PBS配制�20×DAB�10 mg/ml)后,按說明書顯色使用�
8、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作�
六� 操作規程
A� 檢測樣本的預處理
TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在,本說明書*的條件僅為普遍情況,用戶需根椐自已的樣
本材料及試驗結果來調整各個條件,如處理時間、處理濃度等,來優化出適合自身樣本的試驗條件,從而做
出客觀的試驗結果�
1� 對于常規石蠟切片
a� 按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水�
(如:二甲苯脫蠟2次,每次5-10 min;乙醇水合(將脫蠟好的的切片依次放入*乙醇�95%乙醇�
90%乙醇�80%乙醇�70%乙醇2min))
b� 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min�
c� 把b步處理好的樣本加入蛋白酶K工作液, 21-37℃作�15-30min�
(蛋白酶K工作液的配制�2μL 50×蛋白� K�98μL PBS�
d� 把c步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min�
e� 把d步處理好的樣本浸入封閉液中,室溫�15-25℃)封閉10min�
(封閉液的配制: 3%H2O2溶于甲醇�
f� 把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次,每次5min�
g� 然后轉入B步驟標記和顯色反應�
注意事項�
a� 蛋白酶K處理的使用濃度、處理時間及溫度,都因組織的類型不同而有所不同,需要自已摸索優�
上述條件,如有問題,請根椐本說明書的《常見問題的原因�*解決方案》來調整條件。例如:
如果凋亡細胞染色較弱時,可用高濃度的蛋白酶K�400μg/mL)處�5分鐘。(本試劑盒�50×�
白酶K濃度�1mg/mL)�
b� 其它替代方法� 石蠟切片的預處理也可根椐實際情況可采用下述三種替代方法之一,即蛋白酶K
處理的步聚改用下述方法,其余步聚均相同:
替代方法1:
3
將脫蠟及水合好的切片浸入通透液�8-10 min(通透液的配制:0.1%TritonX-100溶于0.1%�
檬酸鈉,需新鮮配制�
替代方法2�
將脫蠟及水合好的切片浸入*�*�8-10 min�*溶液的配制:
0.25%-0.5%溶于HCl PH2�*溶液的配制:0.25%-0.5%溶于0.01N HCl �
替代方法3:
將脫蠟及水合好的切片浸入�200ml 0.1M的檸檬酸緩沖液PH= 6 的塑料盒中,置于微波爐中
350W(低檔)處理5 min。為防止樣本脫落,請使用硅烷(Silane)處理的載玻片或采用多聚賴氨
酸鋪片�
c� 使用酶處理切片時一定要把酶洗滌干凈,否則會嚴重干擾后續的標記反應�
2� 對于難處理的石蠟切片
a� 按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水�
(如:二甲苯脫蠟2次,每次5-10 min;乙醇水合(將脫蠟好的的切片依次放入*乙醇�95%乙醇�
90%乙醇�80%乙醇�70%乙醇2min))
b� 把a步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次,每次5min�
c� 把b步處理好的樣本加入浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩沖液PH= 6 的塑料盒中,置于微波爐中750W
()處理1 min�
d� 迅速加�80ml雙蒸水(20-25℃)加入c步處理好切片的塑料盒中,冷卻至室溫, 將組織切片轉移至
PBS�20-25℃)中�
e� 把d步處理好的樣本浸入封閉液中,室溫�15-25℃)封閉10min�
(封閉液的配制: 0.1M Tris-HCl PH 7.5�3%BSA�20%小牛血清)
f� 把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次,每次10min�
g� 然后轉入B步驟標記和顯色反應�
3� 陽性對照及陰性對照的準備
TUNEL檢測同時需要設陽性和陰性對照,以顯示試驗的客觀性及準確性。因此需要按下述方法準備兩�
樣本來制備陽性及陰性片,其后續步聚與待測樣本同樣進行�
a� 陽性對照樣本的準備
組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后,再加�100μL DNase I反應液(用戶自備)室溫�37℃處�
10 -30 min,其余步驟均相同�
(DNase I反應液的配制�10u-3000u DNase I�40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2,
10mM CaCl2�
b� 陰性對照樣本的準備
在標記反應的過程中不添加TdT酶反應液,其余步驟均相同�
B� 標記和顯色反應:
1� 預處理好的樣本PBS漂洗 2 次,每次5min 后,樣本周圍用濾紙或吸水紙吸干�
2� 配制TdT酶反應液�
4
參考下表配制適當量� TdT 酶反應液(根據需要按照比例放大),需充分混勻。注意:配制好的 TdT
酶反應液必須一次使用完畢,不能凍存�
1個樣� 5個樣� 10個樣�
平衡� 45μl 225μl 450μl
Biotin-dUTP 1μl 5μl 10μl
TdT� 4μl 20μl 40μl
TdT酶反應液總體� 50μl 250μl 500μl
3� 每個樣本滴�50μL TdT酶反應液,加蓋玻�37℃避光濕潤反�60min。(陰性對照片不加TdT酶)
4� 把第3步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min�
5� Streptavidin-HRP及DAB工作液的配制�
Streptavidin-HRP工作液的配制�
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液,需充分混勻。注意:配制好的Streptavidin-HRP工作液必�
一次使用完畢,不宜凍存�
1個樣� 5個樣� 10個樣�
Streptavidin-HRP 0.5μl 2.5μl 5μl
PBS 99.5μl 497.5μl 995μl
Streptavidin-HRP工作液總體積 100μl 500μl 1000μl
DAB 工作液的配制�
a、先把試劑盒中DAB粉末用PBS溶解配制� 20×DAB�10 mg/ml),配制方法如下�
DAB 2mg 5mg 10mg
PBS 0.2ml 0.5ml 1.0ml
配制�20×DAB�10 mg/ml),放于-20℃保�
b、DAB工作液的配制�
參考下表配制適量的DAB工作液,需充分混勻。注意:配制好的DAB工作液必須一次使用完畢,不宜凍存�
1個樣� 5個樣� 10個樣�
20×DAB�10 mg/ml� 5μl 25μl 50μl
30%H2O2 1μl 5μl 10μl
PBS 94μl 470μl 940
DAB工作液總體積 100μl 500μl 1000μl
6� 將第5步處理好的樣本周圍用濾紙或吸水紙吸干,再滴加50μL-100μL Streptavidin-HRP工作液,加蓋�
�37℃濕潤避光反�30min�
7� 把第6步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min,樣本周圍用濾紙或吸水紙吸干�
8� 將第7步處理好的樣本滴�50μL-100μL DAB工作液,室溫孵育5-30分鐘或根據顯色情況孵育適當時間�
注意:如果顯色很強可以短�5分鐘即停止顯色,如果顯色很弱,可以適當延長顯色時間,甚至顯色�
夜�
5
9� 把第8步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次,每次5min,可直接光學顯微鏡下觀察、拍照�
10� 選做(本步驟可不做):用*或甲基綠染色液進行細胞核染色后用光學顯微鏡下觀察、拍照�
具體的步驟請參照操作注意事項中的蘇木素復�
操作注意事項�
1� PBS清洗后,為了各種反應的有效進行,請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應�
2� 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后,請蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進行,這樣可以�
反應液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應液干燥造成實驗失敗�
3� TdT酶反應液即用即配,短暫于冰上保存。不�*保存�*保存會導酶活性的失活�
4� 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配制�
5� 蘇木素復染:將切片放入蘇木素染液,染� 30min ,蒸餾水沖洗干凈后放入鹽酸甲醇溶液中 5s�
立即用蒸餾水沖洗干凈。分別用 70%�85%�95%、無水乙醇浸� 5min。用二甲苯浸� 10min,更�
二甲苯后再浸�10min。晾干后在切片上加中性樹膠,加蓋玻片�
七、常見問題的原因�*解決方案
現象 可能原因 建議
非特異�
染色
TdT酶的濃度過高 用TdT dilution buffer* �1�2�1�10稀�
TdT 酶反應時間過長或 TdT 酶反應過程中反應�
滲漏,細胞或組織表面不能保持濕潤�
注意控制反應時間,并確保 TdT 酶反應液�
很好地覆蓋樣品�
光照紫外線導致包埋試劑的聚合(如:甲基丙烯酸
會導致樣本DNA的斷裂)
嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試�
在固定組織時樣本DNA已斷裂(內源核酸酶的�
用)
確保樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌�
固定
使用了不適當的固定液,例如一些酸性固定液 采用*的固定液
固定后某些核酸酶活性依然較高導致DNA 斷裂 用含有dUTP� dAPT 的溶液封�
標記率低
如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標記效率較低(因
為在固定時染色質未能與蛋白質交聯,而在操作�
丟失�
用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定
或福爾馬林或戊二醛固定�
固定時間過長,導致交聯程度過�
減少固定時間,或用溶于PBS PH7.4�2%�
聚甲醛固�
熒光淬滅
Fluorescence 在普通光� 10 分鐘就會嚴重�
滅,需注意避光操作
促滲條件不佳,以致于試劑不能到達靶分子或濃度
過低
1� 增加通透劑促滲時間
2、增加通透劑的作用溫度(15-25℃)
3、優化蛋白酶K的作用濃度和作用時間(如�
�400ug/ml 作用5min�
4�0.1M的檸檬酸�70℃作�30min�
選擇的染料不合適
用溶�0.1M醋酸*�3-5%甲基�
PH4.0,或蘇木素復�
染色背景
很高
支原體污�
請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為�
原體污染
TdT酶的濃度過高或反應時間過�
用TdT dilution buffer* �1�2�1�10稀�
或注意控制反應時�
紅細胞中血紅蛋白導致的自發熒光產生嚴重干擾� 宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒�
高速分裂和增殖的細胞,有時也會出現細胞核中�
DNA斷裂�
在非高增殖期取樣檢測
DAB孵育時間過長 減少DAB染色時間
Biotin-dUTP的非特異性結�
在TdT酶反應之后,再用�0.1% Triton X-100
�1 mg/ml BSA 的PBS洗三次�
陽性對�
沒有信號
DNase I的濃度過�
1� 冷凍切片使用3u/ml的DNase I
2� 石蠟切片使用 1500u/ml的DNase I
3� 一般樣本使�10u/ml DNase I
組織樣本
從載玻片
脫落
組織樣本被酶從玻片消化下� 降低蛋白酶K 的處理時�
6
*TdT dilution buffer�100mM乙酸鉀(pH6.8), 1 mM 2-mercaptoethanol� 50 % Glycerol
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